sanger测序原理

Sanger测序，又称链终止法测序（Sanger sequencing），是由英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年发明的一种DNA测序方法。这一技术的诞生标志着分子生物学和基因组学的重大突破，为后续的基因研究、人类基因组计划以及现代精准医学奠定了坚实的基础。尽管近年来高通量测序技术（NGS）迅速发展，Sanger测序因其高准确性和稳定性，仍然在许多科研和临床应用中占据重要地位。

Sanger测序的核心原理是利用DNA聚合酶在DNA复制过程中引入链终止核苷酸（ddNTPs），从而产生一系列长度不同的DNA片段。该方法主要包括以下几个步骤：

1. DNA模板准备

首先需要一段已知序列的DNA模板，通常是一个单链DNA片段。该模板会作为合成互补链的起点。

2. 引物退火

在DNA模板上结合一段短的引物（通常是15-20个碱基的寡核苷酸），为DNA聚合酶提供起始点。

3. DNA合成与链终止

在四个独立的反应体系中分别加入四种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP），每种ddNTP会在DNA合成过程中随机替代相应的脱氧核苷三磷酸（dNTP）。由于ddNTP缺乏3'-OH基团，一旦被整合进DNA链，就会阻止后续核苷酸的连接，导致DNA合成终止。

4. 电泳分离

反应结束后，将四个反应体系中的DNA片段混合，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。由于每个片段的长度取决于链终止发生的位置，电泳后会在凝胶上形成一系列条带，对应不同位置的终止点。

5. 序列读取

通过检测放射性或荧光标记的DNA片段在凝胶上的位置，可以确定每个碱基的位置，从而读取DNA序列。

Sanger测序具有较高的准确性，读长可达800-1000个碱基，适用于小片段DNA测序、质粒验证、PCR产物测序以及突变检测等应用场景。虽然其通量较低、成本较高，不适用于大规模基因组测序，但在需要高可信度结果的研究中，如基因编辑验证、法医学鉴定、临床诊断等领域，Sanger测序仍是“金标准”。

Sanger测序的发明不仅推动了生物学研究的发展，也为后续测序技术的革新提供了理论基础。现代荧光标记的Sanger测序结合毛细管电泳技术，已实现自动化操作，大幅提高了效率和便利性。

Sanger测序作为第一代DNA测序技术，不仅具有划时代的意义，也在当今生命科学研究中继续发挥着不可替代的作用。它的原理虽简单，却体现了生物化学与分子生物学的精妙结合，是科学探索精神和技术进步的典范。